·论著· DOI:10. 16689 / j. cnki. cn11-9349 / r. 2022. 03. 015 长链非编码 RNA DRAIC 通过抑制 miR-223-3p 促进肺癌细胞增殖和转移 1王现生, 1于红艳, 1郭小燕, 2侯峰岩( 1河北工程大学附属医院呼吸二科,河北 邯郸 056000; 2河北工程大学附属医院肿瘤二科,河北 邯郸 056000) 摘要: 目的 探究长链非编码 RNA(IncRNA)DRAIC 对 miR-223-3p 的调节作用及对肺癌细胞增殖和转移的影响。 方法选取 2019 年 1 月至 2020 年 6 月河北工程大学附属医院收治的 90 例非小细胞肺癌患者的癌组织和癌旁组织,分析癌症基因组图谱(TCGA)数据中肺癌组织 lncRNA DRAIC 的表达及其与患者预后生存期的关系,实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肺癌组织 lncRNA DRAIC 和 miR-223-3p 的表达水平并进行 Pearson 相关性分析;Starbase 数据库预测及双荧光素酶实验验证 lncRNA DRAIC 与 miR-223-3p 的靶向关系;将经慢病毒包装的 lncRNA DRAIC 和 miR-223-3p 慢病毒质粒分别转染至肺癌细胞 A549 和 H520 中,分为对照组、si-NC 组、si-DRAIC 组、pcDNA 组、pcDNA-DRAIC 组、DRAIC+miR-NC 组、DRAIC+miR223-3p 组;MTT 法和集落形成实验、划痕实验和 Transwell 小室实验分别检测细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力;RT-qPCR 和蛋白印迹法检测 JAK2 和 STAT3 的 mRNA 和蛋白的表达;裸鼠成瘤实验检测移植瘤的发展。 结果 TCGA 数据显示肺癌组织 lncRNA DRAIC 的表达水平高于癌旁组织,且预后生存期与 lncRNA DRAIC 的表达水平呈负相关;与癌旁组织相比,肺癌组织中 lncRNA DRAIC 水平升高,miR-223-3p 水平降低,且 lncRNA DRAIC 与 miR-223-3p 呈负相关;lncRNA DRAIC 水平与肿瘤大小、TNM 分期、淋巴结转移、分化程度呈正相关(P<0. 05)。 lncRNA DRAIC 与 miR-223-3p 存在结合位点,lncRNA DRAIC 过表达抑制 miR-223-3p 的表达(P<0. 05);lncRNA DRAIC 过表达能够上调 JAK2 和 STAT3 的 mRNA 和蛋白水平,促进细胞增殖、划痕愈合和增加侵袭细胞数,促进移植瘤生长(P<0. 05)。 另外,miR-223-3p 可部分逆转 lncRNA DRAIC 对肺癌细胞的恶性表型。 结论 lncRNA DRAIC 通过抑制 miR-223-3p 促进肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及体内移植瘤的发展,且可能通过激活 JAK2 / STAT3 信号通路发挥作用。关键词: 长链非编码 RNA DRAIC;miR-223-3p;JAK2 / STAT3 信号通路;非小细胞肺癌;侵袭;迁移通信作者:侯峰岩,电子邮箱:cjyct1@ 163. com lncRNA DRAIC promotes proliferation and metastasis of lung cancer cells by inhibiting miR-223-3p 1Wang Xiansheng 1 Yu Hongyan 1Guo Xiaoyan 2Hou Fengyan 1Department Ⅱ of Respiratory Sciences Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering Handan 056000 Hebei China 2Department Ⅱof Oncology Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering Handan 056000 Hebei China Abstract Objective To explore the regulatory effect of lncRNA DRAIC on miR-223-3p and its effect on proliferation and metastasis of lung cancer cells. Method The expression of lncRNA DRAIC in lung cancer tissue and paracancer tissues and its relationship with prognosis and survival time of 90 patients with non-small cell lung cancer were analyzed by TCGA data from January 2019 to June 2020 in Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering. The expression of lncRNA DRAIC and miR-223-3p in lung cancer tissue was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction RT-qPCR and the correlation of Pearson was analyzed. Starbase prediction and double luciferase test were used to verify the targeting relationship of lncRNA DRAIC to miR-223-3p. The lentivirus-packaged lncRNA DRAIC and miR-223-3p lentivirus plasmids were transfected into lung cancer cells A549 and H520 respectively and were divided into control group si-NC group si-DRAIC group pcDNA group pcDNA-DRAIC group DRAIC+miR-NC group and DRAIC+miR-223-3p group. The ability of cell proliferation migration and invasion were detected by MTT assay and colony formation test scratch test and Transwell chamber test respectively. RT-qPCR and western blot method were used to detect the expression of mRNA and protein of JAK2 and STAT3. The tumorigenesis experiment in nude mice was used to detect the development of transplanted tumors. Result TCGA data showed that the expression level of lncRNA DRAIC in lung cancer tissues was higher than that in paracancer tissues and the prognostic survival time was negatively correlated with the expression level of lncRNA DRAIC. Compared with the paracancer tissues the level of lncRNA DRAIC in lung cancer tissues increased and the level of miR-223-3p decreased and the levels of lncRNA DRAIC and miR-223-3p showed a negative correlation. The level of lncRNA DRAIC is positively correlated with tumor size TNM stage lymph node metastasis and differentiation P<0. 05 . There is a binding site between lncRNA 肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 ·363· DRAIC and miR-223-3p and the overexpression of lncRNA DRAIC inhibits the expression of miR-223-3p P<0. 05 and can upregulate the levels of mRNA and protein of JAK2 and STAT3 promote cell proliferation increase scratch healing and the number of invaded cells and promote the growth of transplanted tumors P<0. 05 . And miR-223-3p can partially reverse the malignant phenotype of lncRNA DRAIC on lung cancer cells. Conclusion lncRNA DRAIC promotes the proliferation migration and invasion of lung cancer cells and the development of transplanted tumors in vivo by inhibiting miR-223-3p and it may play a role by activating the JAK2 / STAT3 signaling pathway. Key words Long non-coding RNA DRAIC miR-223-3p JAK2 / STAT3 signaling pathway Non-small cell lung cancer Invasion Migration 非小细胞肺癌 ( non - small cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌的 85%,是肺癌中最常见的组织病理类型,其发病率和死亡率居恶性肿瘤首位[1,2] 。由于肺癌早期缺乏可靠的标志物和抑制肿瘤转移的靶标, 使 得 肺 癌 患 者 5 年 生 存 率 仅 为 16% ~ 18% [3,4] 。 鉴于目前肺癌早期诊断和治疗手段的局限性,研究与 NSCLC 进展相关的生物标志物有助于提高肺癌的治疗效果和改善预后。 近年来,长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)成为研究的热点。 lncRNA 是一类核苷酸长度>200 nt、无编码蛋白质功能的 RNA,可参与细胞增殖、分化、凋亡等过程[5] 。 越来越多的证据表明,lncRNA 参与肺癌发生、发展及耐药性的产生,如 lncRNA ABHD11 - AS1 [6] 、 lncRNA LINC00240 [7] 、 lncRNA PGM5P4 - AS1 [8] 等。 Li C 等[9] 发现胶质瘤细胞中 lncRNA DRAIC 表达量降低,其高表达可促进胶质瘤细胞的凋亡并抑制其增殖。 Zhang Z 等[10] 发现 lncRNA DRAIC 在 胃 癌 组 织 和 细 胞 系 中 低 表 达, lncRNA DRAIC 过 表 达 通 过 干 扰 泛 素 羧 基 端 水 解 酶 L5 (ubiquitin carboxyl terminal hydrolase L5,UCHL5)介导的核因子相关 κB 结合蛋白(nuclear factor related to κB binding protein,NFR κB)去泛素化而抑制胃癌细胞 的 增 殖 和 转 移。 Liao B 等[11] 发 现 lncRNA DRAIC 在鼻咽癌组织中表达增加,且与患者的晚期临床分期呈正相关;敲低 lncRNA DRAIC 则抑制鼻咽癌细胞的生长、迁移和侵袭。 李晗宇和陈飞[12] 发现 lncRNA DRAIC 通过调控 miR-181 的表达激活 JAK1 / STAT2 磷酸化进而促进卵巢癌细胞的恶性生物学行 为 的 发 生。 然 而, 目 前 尚 未 报 道 lncRNA DRAIC 与肺癌的关联及影响。因此,本研究拟探讨 lncRNA DRAIC 在 NSCLC 组织和细胞中的表达水平,以及对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭及 JAK2 / STAT3 信号通路的影响,为 NSCLC 的治疗提供理论和实验依据。 1 材料与方法 1. 1 临床资料 选取 2019 年 1 月至 2020 年 6 月河北工程大学附属医院收治的 90 例 NSCLC 患者病理活检或手术中切除的肺癌组织及相应癌旁组织( > 癌灶 5 cm 处)标本。 纳入标准:①经组织病理学诊断后确诊为 NSCLC 的患者;②患者在手术前未经放疗、化疗,未服用过靶向药物;③临床资料完整。 排除标准:①合并其他恶性肿瘤者;②合并严重心、肝、肾等重要脏器功能障碍者;③妊娠期或哺乳期女性。 收集患者所有临床资料,患者均自愿提供肺癌组织及癌旁组织标本。 本研究经过河北工程大学附属医院伦理委员会批准(批件号:2020026)。 1. 2 研究材料 NSCLC 细胞系 A549、H520、H1703 和正常肺上皮细胞系 BEAS-2B 购自中国科学院上海细胞库;BALB / c 裸鼠[使用许可证号:SYXK(京) 20190030]购自斯贝福(北京) 生物技术有限公司; MTT 试剂盒、Lipofectamine TM 3000 试剂盒、蛋白印迹试剂盒购自美国 Invitrogen 公司;反转录试剂盒、实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒购自日本 TaKaRa 公司;Transwell 小室购自美国 SD 公司;si-DRAIC、si -NC、 pcDNA -DRAIC、 pcDNA、miR - 223- 3p、 miR-NC 购自上海吉凯基因化学技术有限公司; JAK2、STAT3、GAPDH 抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公 司; pLVX - EGFP - IRES - neo 载 体、 pHelper 1. 0 及 pHelper 2. 0 辅助包装质粒均购自上海信裕生物科技有限公司;DH5α 感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司;限制性核酸内切酶 Xho I 和 Not I 及 T4 DNA 连接酶购自上海碧云天生物技术有限公司;IXplore Standard 倒置显微镜购自日本 Olympus 公司;3K15 低温高速离心机购自德国 Sigma 公司;SpectraMax i D5 酶标仪购自美国 Thermo 公司; RT - qPCR 仪购自美国热电公司; 苏净 Airtech 超净工作台购自美国 Thermo Fisher 公司。 1. 3 方法 1. 3. 1 细胞培养与分组 细胞培养:A549、H520、 H1703 和 BEAS - 2B 细胞株用含 10% 胎牛血清的 ·364· 肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 RPMI 1640 培养基,在 37 ℃ 、5% CO2 条件下常规培养。 每 2 天更换新鲜培养基,当细胞密度达到 80% 时,用 0. 25%胰蛋白酶进行消化并传代。细胞分组:根据 Lipofectamine TM 3000 说明书,将 A549 和 H520 细胞分别转染 DRAIC 干扰表达载体及阴性对照、DRAIC 过表达载体及阴性对照、DRAIC 过表达载体和 miR-223-3p 模拟物及阴性对照, 记作 si -DRAIC 组、 si -NC 组、 pcDNA -DRAIC 组、 pcDNA 组、DRAIC+miR- 223 - 3p 组、DRAIC+miRNC 组,未转染的 A549 和 H520 细胞分别作为对照组。 1. 3. 2 靶标预测与双荧光素酶实验 使用 Starbase 数据库预测, 发现 miR - 223 - 3p 可能是 lncRNA DRAIC 的潜在下游靶标。 将 DRAIC 野生型(DRAIC 3'UTR-WT)和突变型(DRAIC 3'UTR-MUT)荧光素酶表达载体分别与 miR-NC 和 miR-223-3p 混合, 通过 Lipofectamine TM 3000 共转染至 A549 和 H520 细胞中。 转染 48 h 后,收集各组细胞制备细胞裂解物,采用双荧光素酶报告基因检测系统( Promega) 检测荧光素酶活性。 1. 3. 3 RT - qPCR 检测肺癌组织及细胞中 lncRNA DRAIC、miR-223-3p、JAK2 和 STAT3 的表达 采用 Trizol 试剂从肺癌组织和细胞中提取总 RNA。 使用反转 录 试 剂 盒 将 RNA 反 转 录 为 cDNA, 并 使 用 SYBR Green 法进行扩增,U6 作内参。 反应条件为 95 ℃预变性 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共 40 个循环。 使用 2 -ΔΔCT 公式计算 lncRNA DRAIC、miR-223- 3p 的相对表达水平。 PCR 引物序列,见表 1。 1. 3. 4 MTT 法和细胞集落形成数目检测细胞增殖能力 细胞转染 24 h 后, 消化细胞并调整密度为 1×10 3 / 孔并接种于 96 孔板培养,每组设 3 个复孔, 分别培养 24 h、48 h、72 h、96 h,加入 MTT 溶液, 37 ℃孵育 4 h,离心去上清,加入 DMSO,使用酶标仪于 450 nm 波长处检测吸光度值。将转染细胞调整密度为 1×10 3 / 孔接种于 6 孔板培养,每组设 3 个复孔。 培养 10 d 后,用 4%多聚甲醛溶液固定,用结晶紫染色,倒置显微镜(40×)观察菌落形成情况并拍照。 1. 3. 5 划痕实验检测细胞迁移能力 将 A549 和 H520 细胞接种于 6 孔板,细胞分组及培养条件同 1. 3. 1。 细胞培养 48 h 后进行胰酶消化,后接种于新 6 孔板中,每组设 3 个复孔,当细胞呈现单层贴壁生长时,使用 200 μl 移液器枪头进行划痕,PBS 洗去脱落的细胞,加入无血清培养液,显微镜下观察并记录划痕宽度。 继续培养 24 h 后,显微镜下再次观察记录划痕宽度。 细胞划痕愈合率= (0 h 划痕宽度-24 h 划痕宽度) / 0 h 划痕宽度×100%,用细胞划痕愈合率表示细胞迁移率。 1. 3. 6 Transwell 小室实验检测细胞侵袭能力 在 Transwell 小室平板平铺一层 matrigel 基质胶( 约 50 μl),并将以无血清培养基中的各组单细胞悬液加至上室,在小室下室平铺含有 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基,置入 37 ℃ 、5% CO2 培养箱中培养 24 h,PBS 清洗后,甲醛固定,结晶紫染色后,显微镜下观察并对穿过膜的细胞进行统计计数。 1. 3. 7 蛋白印迹法检测细胞 JAK2 和 STAT3 的表达 A549 和 H520 细胞加入细胞裂解液,离心所得的上清即为蛋白样品。 用 BCA 蛋白检测试剂盒测定各组蛋白浓度,蛋白定量变性后进行 SDS-PAGE 电泳分离蛋白,电泳后迅速转至 PVDF 膜上,放入含 5%脱脂牛奶 TBST 溶液中室温封闭 2 h,分别加入 JAK2 和 STAT3 对应一抗(浓度为 1 ∶ 2000) 4 ℃ 过夜。 TBST 洗 涤 3 次 后, 加 入 二 抗 ( 浓 度 为 1 ∶ 10 000)室温孵育 2 h,最后避光下加入 ECL 显色剂显色,Bio-Rad 凝胶成像仪记录蛋白灰度并拍照,以 GAPDH 作为对照,对各组蛋白进行相对定量分析。 1. 3. 8 裸鼠致瘤试验 重组慢病毒载体的构建、鉴定、包装及浓缩:采用限制性核酸内切酶 Xho I 和 Not I 双酶切 lncRNA DRAIC 全基因序列的 PCR 扩增产物及 pLVX-EGFP -IRES-neo 载体,16 ℃ 条件下,采用 T4 DNA 连接酶连接反应 2 h,转化 DH5α 感受态细胞,收集菌液,接种至含有 100 mg / L 氨苄表 1 PCR 引物序列目的片段 上游引物 下游引物 lncRNA DRAIC 5'-ATCTTTAGCTGGAGTTCGA-3' 5'-AAGGCTTGAGGGCGAGCGAT-3' JAK2 5'-GAGAATGGCGACTACAATC-3' 5'-GAACAGCACCTGCTAAACTG-3' STAT3 5'-GGCTCTATGGAATGAAGGGTA-3' 5'-CAACTGACTGGATCTGGGTCT-3' GAPDH 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3' 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' miR-223-3p 5'-GGGGTGTCAGTTTGTCAAA-3' 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3' U6 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' 肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 ·365· 青霉素的 LB 琼脂培养基中 37 ℃ 倒置培养 16 h。挑选抗性菌落转移至液体 LB 培养基中进行扩增培养, 提 取 质 粒 进 行 酶 切 鉴 定。 采 用 Lipofectamine TM 3000 将重组慢病毒质粒 pLVX-si-DRAIC-EGFP- IRES - neo、 pLVX - si - NC - EGFP - IRES - neo、 pLVX- pcDNA - EGFP - IRES - neo、 pLVX - pcDNA - DRAIC - EGFP - IRES - neo 分别与 pHelper 1. 0 及 pHelper 2. 0 辅助包装质粒共转染 A549 细胞,8 h 后,更换为 DMEM 完全培养基继续培养 48 h,分别经 1000 r/ min 离心、0. 45 μm 过滤器过滤、53 125 r/ min 高速离心、0. 22 μm 过滤器过滤收集病毒浓缩液。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,当荧光率达到 80%时,且细胞状态正常,说明成瘤细胞制备成功,收集并进入后续实验。分组:采用随机数字表法将 40 只裸鼠随机分为 5 组,分别为对照组(感染未携带慢病毒载体 A549 细胞的裸鼠)、si-NC 组(感染携带 si-NC 慢病毒载体 A549 细胞的裸鼠)、si-DRAIC 组(感染携带 siDRAIC 慢病毒载体 A549 细胞的裸鼠)、pcDNA 组 (感染携带 pcDNA 慢病毒载体 A549 细胞的裸鼠)、 pcDNA-DRAIC 组(感染携带 pcDNA-DRAIC 慢病毒载体 A549 细胞的裸鼠),每组 8 只。 在各组裸鼠右肩背部皮下分别注射 0. 2 ml 1×10 7 / ml 已转染慢病毒的 A549 细胞悬液。 正常饲养,观察裸鼠皮下成瘤情况。 第 30 天处死裸鼠,完整取出皮下肿瘤称重并测量体积。 1. 3. 9 统计学方法 数据分析应用软件 SPSS 22. 0, 符合正态分布的计量资料用( x??±s) 表示,组间比较采用独立 t 检验;计数资料用[例(%)]表示,组间比较采用 χ 2 检验,P<0. 05 为差异具有统计学意义。 2 结果 2. 1 lncRNA DRAIC 在肺癌组织和细胞中的表达癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA) 数据库显示,与癌旁组织相比,lncRNA DRAIC 在肺癌组织中表达上调( P < 0. 05) ( 图 1A)。 Kaplan - Meier 曲线分析表明,与 lncRNA DRAIC 表达水平低的患者相比,lncRNA DRAIC 表达水平较高的患者其 10 年整体生存率降低(P<0. 05)(图 1B)。图 1 lncRNA DRAIC 在肺癌组织和肺癌细胞系中的表达注:TCGA,The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图谱。 A,TCGA 中 lncRNA DRAIC 在肺癌组织中被上调;B,Kaplan-Meier 曲线评估 TCGA 中肺癌患者的预后情况;C,RT-qPCR 检测 90 对肺癌组织及癌旁组织中 lncRNA DRAIC 表达水平;D,RT-qPCR 检测正常肺上皮细胞系及肺癌细胞系中 lncRNA DRAIC 表达。 a 与癌旁组织和正常肺上皮细胞系相比,P<0. 05。 ·366· 肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 同时评估 90 对肺癌组织及癌旁组织中 lncRNA DRAIC 表达水平, 发现与癌旁组织相比, lncRNA DRAIC 表达水平在肺癌组织显著上调( P < 0. 05) (图 1C),与 TCGA 数据一致。 另外,比较正常肺上皮细胞系 BEAS - 2B 和肺癌细胞系 A549、H520 与 H1703 的 lncRNA DRAIC 表达发现,肺癌细胞系中 lncRNA DRAIC 表达水平要高于正常肺上皮细胞系 (P<0. 05) (图 1)。 最后分析 lncRNA DRAIC 表达水平与患者临床病理特征之间的关联,按照 lncRNA DRAIC 相对表达量(平均水平) 分为高表达组(56 例)和低表达组(34 例),发现 lncRNA DRAIC 表达水平与肿瘤大小、TNM 分期、分化程度、淋巴结转移存在相关性,当肿瘤>5 cm、TNM 分期为Ⅲ ~ Ⅳ期、分化程度越高、淋巴结有转移时,lncRNA DRAIC 表达水平越高(P<0. 05),见表 2。 2. 2 lncRNA DRAIC 靶向调控 miR- 223 - 3p Starbase 在线数据库预测 miR-223-3p 是 lncRNA DRAIC 的潜在下游靶标,见图 2A。 荧光素酶报告基因实验 结 果 表 明, miR - 223 - 3p 对 野 生 型 lncRNA DRAIC 表达有明显下调作用(P<0. 05),而对突变型没有明显作用,说明 lncRNA DRAIC 可靶向作用于 miR-223-3p,见图 2B、2C。 同时,RT-qPCR 检测 A549 和 H520 细胞中 lncRNA DRAIC 和 miR-223- 3p 的表达水平发现,与 si-NC 组相比,si-DRAIC 组 lncRNA DRAIC 表达下调,miR-223-3p 表达上调(P <0. 05),见图 2D、2E;与 pcDNA 组相比, pcDNA - DRAIC 组 lncRNA DRAIC 表达上调,miR- 223 - 3p 表达下调(P< 0. 05),与 DRAIC+miR-NC 组相比, DRAIC+miR-223-3p 组 lncRNA DRAIC 表达下调, miR- 223 - 3p 表达上调 ( P < 0. 05), 说明 lncRNA DRAIC 可以影响内源性 miR- 223 - 3p 水平,miR223-3p 可以影响内源性 lncRNA DRAIC 水平。 另外,与癌旁组织相时比,miR-223-3p 表达水平在肺癌组织中明显下调(P<0. 05),见图 2F,且 lncRNA DRAIC 表达水平与 miR-223-3p 表达水平呈现负相关(r = -0. 5275,P<0. 001),见图 2G。表 2 lncRNA DRAIC 的表达水平与患者临床病理特征的关系项目 例数(例) lncRNA DRAIC 水平[例(%)] 低表达(n = 34) 高表达(n = 56) χ 2 值 P 值年龄 0. 293 0. 588 ≤60 岁 43 15(44. 12) 28(50. 00) >60 岁 47 19(55. 88) 28(50. 00) 性别 2. 446 0. 118 男 57 25(73. 53) 32(57. 14) 女 33 9(26. 47) 24(42. 86) 吸烟史 3. 245 0. 072 有 42 20(58. 82) 22(39. 29) 无 48 14(41. 18) 34(60. 71) 肿瘤直径 9. 137 0. 003 ≤5 cm 35 20(58. 82) 15(26. 79) >5 cm 55 14(41. 18) 41(73. 21) 病理类型 1. 194 0. 551 腺癌 60 25(73. 53) 35(62. 50) 鳞癌 24 7(20. 59) 17(30. 36) 大细胞癌 6 2(5. 88) 4(7. 14) TNM 分期 36. 968 <0. 001 Ⅰ~Ⅱ期 31 25(73. 53) 16(28. 57) Ⅲ~Ⅳ期 59 9(26. 47) 40(71. 43) 分化程度 6. 173 0. 013 低、中分化 38 20(58. 82) 18(32. 14) 高分化 52 14(41. 18) 38(67. 86) 淋巴结转移 6. 537 0. 011 有 42 10(29. 41) 32(57. 14) 无 48 24(70. 59) 24(42. 86) 肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 ·367· 图 2 lncRNA DRAIC 靶向调控 miR-223-3p 注:A,lncRNA DRAIC 和 miR-223-3p 结合示意图;B、C,荧光素酶报告基因实验验证 miR-223-3p 与 lncRNA DRAIC 存在靶向调控作用; D,RT-qPCR 检测 miR-223-3p 影响内源性 lncRNA DRAIC 的水平;E,RT-qPCR 检测 lncRNA DRAIC 影响内源性 miR-129-5p 的水平;F,RTqPCR 检测 90 例肺癌患者肺癌组织 miR-223-3p 表达;G,Pearson 线性分析肺癌组织中 lncRNA DRAIC 与 miR-223-3p 的相关性。 a 与癌旁组织和 si-NC 组相比,P<0. 05; b 与 pcDNA 组相比,P<0. 05; c 与 DRAIC+miR-NC 组相比,P<0. 05。 2. 3 lncRNA DRAIC 通过 miR-223-3p 促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭 为了观察 lncRNA DRAIC 表达对肺癌细胞恶性行为的影响,通过 MTT 实验、集落形成实验、划痕愈合实验和 Transwell 实验测定肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。 与 si -NC 组相比,si - DRAIC 组 24 h、48 h、72 h、96 h OD 值降低(图 3A、 3B),单克隆形成数目减少(图 3C),划痕变宽,愈合率降低(图 3D),细胞侵袭数减少(图 3E)(P<0. 05);与 pcDNA 组相比,pcDNA-DRAIC 组 24 h、48 h、72 h、 96 h OD 值升高,单克隆形成数目增加,划痕变窄,愈合率增加,细胞侵袭数增加(P<0. 05);与 DRAIC+ miR-NC 组相比,DRAIC+miR-223-3p 组 24 h、48 h、 72 h、96 h OD 值降低,单克隆形成数目减少,划痕变宽,愈合率降低,细胞侵袭数减少(P<0. 05)。 说明 lncRNA DRAIC 通过靶向 miR-223-3p 表达促进肺癌细胞 A549 和 H520 的增 殖、迁 移 和 侵 袭, lncRNA DRAIC 在肺癌细胞中扮演了致癌基因的角色。 2. 4 lncRNA DRAIC 通过 miR-223-3p 激活 JAK2 / STAT3 信号通路 为了观察 lncRNA DRAIC 对肺癌细胞恶性行为的作用机制,利用 RT-qPCR 及蛋白印迹法测定肺癌细胞 JAK2、STAT3 的 mRNA 和蛋白表达水平。 发现与 si - NC 组相比, si - DRAIC 组 JAK2、STAT3 的 mRNA(图 4A、4C)和蛋白表达水平下调(P<0. 05)(图 4B、4D);与 pcDNA 组相比,pcDNA-DRAIC 组 JAK2、STAT3 的 mRNA 和蛋白表达水平上调(P< 0. 05);与 DRAIC+miR-NC 组相比, DRAIC+miR-223-3p 组 JAK2、STAT3 的 mRNA 和蛋白表达水平下调(P<0. 05)。 上述结果说明,lncRNA DRAIC 可能通过靶向调控 miR-223-3p 的表达激活 JAK2 / STAT3 信号通路。 ·368· 肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 图 3 lncRNA DRAIC 通过 miR-223-3p 促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭注:A、B,MTT 实验检测细胞活性;C,集落形成实验检测细胞增殖能力( ×40);D,划痕愈合实验检测细胞迁移能力;E,Transwell 实验检测细胞侵袭能力。 a 与 si-NC 组相比,P<0. 05; b 与 pcDNA 组相比,P<0. 05; c 与 DRAIC+miR-NC 组相比,P<0. 05。肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 ·369· 图 4 lncRNA DRAIC 通过 miR-223-3p 激活 JAK2 / STAT3 信号通路注:A、C,RT-qPCR 检测细胞 JAK2、STAT3 的 mRNA 水平;B、D,蛋白印迹法检测细胞 JAK2、STAT3 蛋白表达水平。 a 与 si-NC 组相比,P< 0. 05; b 与 pcDNA 组相比,P<0. 05; c 与 DRAIC+miR-NC 组相比,P<0. 05。 ·370· 肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 图 5 lncRNA DRAIC 促进体内肿瘤生长注:A,裸鼠移植肿瘤生长情况;B,肿瘤质量;C,肿瘤体积。 a 与 si-NC 组相比,P<0. 05; b 与 pcDNA 组相比,P<0. 05。 2. 5 lncRNA DRAIC 促进体内肿瘤生长 为了确认 lncRNA DRAIC 在体内对肺癌发展的影响,将稳定转染 si-DRAIC、pcDNA-DRAIC 和对照载体的 A549 细胞,注射到裸鼠皮下。 与 si-NC 组相比,si-DRAIC 肿瘤大小(图 5A)、重量(图 5B)及体积(图 5C) 下降(P<0. 05);与 pcDNA 组相比,pcDNA-DRAIC 肿瘤大小、重量及体积增加(P<0. 05),说明 lncRNA DRAIC 促进体内肿瘤生长。 2. 6 lncRNA DRAIC 通过 miR-223-3p 调控肺癌恶性表型的作用机制 通过检测肺癌组织和肺癌细胞中 lncRNA DRAIC 和 miR-223-3p 的水平,发现 miR-223- 3p 在肺癌组织和细胞中表达下调,lncRNA DRAIC 表达上调,同时 miR-223-3p 与 lncRNA DRAIC 存在靶向关系,说明 lncRNA DRAIC 与肺癌进展相关。 为了进一步观察 lncRNA DRAIC 对肺癌细胞恶性行为的影响,本研究检测了肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。发现过表达 lncRNA DRAIC 促进细胞的增殖和侵袭转移;同时 JAK2/ STAT3 信号通路相关蛋白表达增加;而过表达 miR-223-3p 能逆转上述影响。 由此推断过表达 lncRNA DRAIC 靶向抑制 miR-223-3p 能够促进癌细胞的恶性生物学行为,见图 6。 3 讨论 lncRNA 通常以转录或转录后方式调节基因的表达,包括致癌基因和抑癌基因,进而发挥生物学作用[13] 。 lncRNA DRAIC 是一种新型 lncRNA,位于人类染色体 15q23 位置。 一项研究表明其在癌症发生、发展的调控中扮演了重要的角色[14] 。 Saha S 等[15]发现 lncRNA DRAIC 通过与 IκB kinase β 抑制剂相互作用抑制 NF-κB 通路激活,从而抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭及异种移植肿瘤的生长,抑制图 6 lncRNA DRAIC 通过 miR-223-3p 调控肺癌恶性表型的作用机制前列腺癌进展。 邓清等[16]发现 lncRNA DRAIC 调控 miR-223 的表达,抑制其表达可以抑制胃癌细胞迁移和侵袭,促进其细胞凋亡。 Tiessen I 等[17] 发现 DRAIC 在多种癌组织和细胞中高表达,干扰 DRAIC 表达后能够抑制癌细胞增殖及自噬水平。 尽管 TCGA 和 RNA 测序数据已经表明 lncRNA DRAIC 在肺癌中上调,但至今未有详细的实验数据阐明 lncRNA DRAIC 在肺癌发生中的作用机制。 本研究发现,肺癌组织及细胞中 lncRNA DRAIC 表达明显高于癌旁组织和正常肺上皮细胞,且发现 lncRNA DRAIC 表达水平与肿瘤大小、TNM 分期、淋巴结转移、分化程度存在正相关的关系(P<0. 05)。 同时细胞学实验显示,敲低 lncRNA DRAIC 水平后,A549 和 H520 细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱,并能抑制裸鼠体内移植瘤的发展;过表达 lncRNA DRAIC 后, A549 和 H520 细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 ·371· 强,裸鼠体内移植瘤发展迅速,说明 lncRNA DRAIC 在肺癌中发挥促癌作用。对 miR-223-3p 展开生物信息学分析,发现并验证它能够靶向作用于 lncRNA DRAIC。 miR-223- 3p 在多种癌症中呈现低表达,干预致其过表达可抑制多种癌细胞的增殖和迁移[18-19] 。 Xu J 等[20] 发现 miR-223-3p 在肝癌中表达降低,miR-223-3p 可通过调控脂肪非典型钙黏蛋白 1 抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质化等恶性表型。 Zhao Y 等[21] 发现 miR-223-3p 在乳腺癌组织中低表达,过表达 miR-223-3p 可抑制糖酵解代谢,调节 PFN2 表达, 从而抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移,促进细胞凋亡。 王熙凯等[22]发现 miR-223-3p 在 NSCLC 组织和细胞系中的表达降低,miR-223-3p 的过表达抑制了 NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭,并诱导了细胞凋亡。 同样,冯坤丽等[23]也证明 miR-223-3p 在肺癌细胞系( HCI -H520 和 SK-MES - 1) 中下调, miR-223-3p 的过表达抑制细胞的增殖、迁移能力, 诱导细胞凋亡,并增加顺铂敏感度。 本研究发现, miR-223-3p 可能充当肿瘤抑制因子,过表达 miR223-3p 可部分逆转 lncRNA DRAIC 对肺癌细胞的增殖、 迁 移 和 侵 袭 作 用, 说 明 lncRNA DRAIC 和 miR-223-3p 在肺癌中存在靶向调控关系。 JAK2 是一种非受体型酪氨酸激酶,通过结合细胞因子及其受体激活下游 STAT3,进而调控下游靶基因的表达,在细胞增殖、分化及迁移过程中发挥重要 作 用, 其 活 性 与 恶 性 肿 瘤 的 发 生 密 切 相关[24-25] 。 多种 lncRNA 通过 JAK2 / STAT3 信号通路来调控恶性肿瘤的发生发展[26-27] 。 Shi JD 等[28] 发现 lncRNA 小核仁 RNA 宿主基因 3 通过激活 JAK2 / STAT3 信号通路促进 NSCLC 细胞的增殖、迁移和上皮间质化。 Li SJ 等[29]发现 lncRNA 00152 通过激活 JAK2 / STAT3 通 路 促 进 肝 细 胞 癌 进 展。 李 升 平等[30]发现 JAK2 / STAT3 信号通路被过表达 lncRNA HOX 转录反义基因间 RNA 激活,从而增强肾上腺肿瘤细胞的凋亡和炎症水平。 本研究结果表明,过表达 lncRNA DRAIC 后,肺癌细胞株中 JAK2、STAT3 的 mRNA 和蛋白水平升高,敲减 lncRNA DRAIC 后, JAK2、STAT3 的 mRNA 和蛋白水平降低,说明 lncRNA DRAIC 通过激活 JAK2 / STAT3 信号通路促进肺癌进展,与上述研究结果一致。综上所述,lncRNA DRAIC 通过抑制 miR-223- 3p 促进肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及体内移植瘤的发展,可能通过激活 JAK2 / STAT3 信号通路发挥作用。 这些结果为 lncRNA DRAIC 的致瘤作用机制提供了实验基础,有助于确认新的肺癌生物标志物及潜在的靶向目标。参考文献 1 CUI C H LIU Y GERLOFF D et al. 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Eur Rev Med Pharmacol Sci 2019 23 3 1038-1046. 30 李升平 贺利明 马锋 . lncRNA HOTAIR 通过介导 JAK2 / STAT3 通路调节肾上腺肿瘤细胞增殖和凋亡的机制 J . 临床和实验医学杂志 2021 20 3 253-256. 收稿日期 2021-11-01 本文编辑 张 艳 ·研究快讯· 中国常见恶性肿瘤患者恶液质状况近日,学术期刊 Precision Nutrition 发表了中国常见恶性肿瘤患者营养状态与临床结局相关性研究( Investigation on Nutrition Status and its Clinical Outcome of Common Cancers,INSCOC)项目的重要研究成果。 论文题为“Cancer cachexia statistics in China”(中国常见恶性肿瘤患者恶液质状况调查)。恶液质是一种副肿瘤综合征,恶液质对肿瘤患者的生活质量和预后有着严重的负面影响。 据估计,超过 22%的肿瘤患者死于恶液质,在晚期肿瘤患者中更为普遍。 本研究调查了我国常见恶性肿瘤患者恶液质的患病情况。 这项前瞻性队列研究采用随机抽样方法抽取了全国共 47 604 例 16 种常见恶性肿瘤住院患者,以 2011 Delphi 国际共识标准来诊断恶液质。 我国肿瘤恶液质患病率高达 37%,恶液质患病率存在瘤种、年龄、性别、TNM 分期及地区差异:胰腺癌患者患病率最高(63. 3%),乳腺癌患者患病率最低(15. 4%),消化系统肿瘤患者患病率整体较高;<45 岁年龄组患者患病率最低(30. 7%),≥70 岁年龄组患者患病率最高 (44. 8%);男性患病率高于女性(40. 5% ∶ 32. 7%);TNM 分期较高的患者其恶液质患病率也较高, 其中胰腺癌Ⅲ、Ⅳ期患者患病率最高;西北区域恶液质患病率最高(50. 4%),东北区域患病率最低(26. 6%)。 此外, 在某些肿瘤类型中,不同民族、医疗保险类型、居住地、职业、受教育水平的患者恶液质患病率也存在显著差异,农民、小学及以下低教育水平患者恶液质患病率最高。 本研究还分析了恶液质患者的生活质量、功能状态以及营养状况之前的关系,结果表明患者较差的生活质量和功能状态与营养状况的恶化有关。这是中国迄今为止最大的一项肿瘤恶液质的研究,以上数据对了解我国肿瘤恶液质的流行情况,制订国家和区域政策,并采取相应的预防和治疗措施具有重要意义。链接:https: / / journals. lww. com / pn / pages/ default. aspx 肿瘤代谢与营养电子杂志 2022 年 6 月 9 日第 9 卷第 3 期 Electron J Metab Nutr Cancer, Jun. 9, 2022, Vol. 9, No. 3 ·373·